Горностай наиболее многочислен в лесостепных, таёжных и тундровых районах. Выбор им места обитания определяется обилием основного корма — мелких грызунов. Как правило, горностай предпочитает селиться неподалёку от воды: по берегам и поймам рек и ручьёв, у лесных озёр, по прибрежным лугам, зарослям кустарника и тростника. В глубину лесных массивов заходит редко; в лесах держится старых зарастающих гарей и вырубок, опушек (особенно неподалёку от селений и пашен); в густых лесах любит приручьевые ельники и ольшатники. Обычен в перелесках, по степным оврагам и балкам. Открытых пространств избегает. Иногда поселяется вблизи человеческого жилья, на полях, в садах и лесопарках, даже на окраинах городов.
Ведёт преимущественно одиночный территориальный образ жизни. Границы индивидуального участка метятся секретом анальных желез. Размеры участка варьируются от 10 до 20 га; у самцов он, как правило, вдвое больше, чем у самок, и пересекается с их участками. Самцы и самки живут раздельно и встречаются только во время брачного сезона. В голодные и малокормные годы горностаи покидают свои участки и переселяются, порой на значительные расстояния. Иногда миграции вызывает и массовое размножение грызунов в соседних районах.
Активен горностай преимущественно в сумеречно-ночные часы, иногда встречается и днём. В выборе убежищ, в том числе выводковых, неприхотлив. Его можно встретить в самых неожиданных местах — например, в стогах сена, кучах камней, в развалинах покинутых зданий или в брёвнах, сложенных у стены жилого дома. Занимает также дупла деревьев, часто прячется в них при паводке. Нередко горностай занимает норы и гнездовые камеры убитых им грызунов. Свою выводковую нору самка выстилает шкурками и шерстью убитых грызунов, реже сухой травой. Самостоятельно горностай нор не роет. Зимой постоянных убежищ не имеет и пользуется случайными укрытиями — под камнями, корнями деревьев, брёвнами. На место днёвки повторно возвращается редко.
Горностай хорошо плавает и лазает, но по существу это специализированный наземный хищник. В его рационе преобладают мышевидные грызуны, но в отличие от своего родича — ласки, питающейся мелкими полёвками, горностай охотится на более крупных грызунов — водяную полёвку, хомяка, бурундука, сеноставок, леммингов и др., настигая их в норах и под снегом. Размеры не позволяют ему проникать в норы более мелких грызунов. Самки охотятся в норах чаще, чем самцы. Второстепенное значение в рационе горностая имеют птицы и их яйца, а также рыба и землеройки. Ещё реже (при недостатке основных кормов) горностай поедает земноводных, ящериц и насекомых. Способен нападать на животных крупнее себя (глухарей, рябчиков, белых куропаток, зайцев и кроликов); в голодные годы ест даже отбросы или похищает у людей запасы мяса и рыбы. При изобилии пищи горностай устраивает запасы, истребляя больше грызунов, чем может съесть. Добычу убивает, как ласка, — прокусывая череп в затылочной области. Грызунов горностай выслеживает, ориентируясь на запах, насекомых — на звук, рыбу — с помощью зрения.
Горностай — весьма подвижное и ловкое животное. Его движения быстры, но несколько суетливы. На охоте за сутки он проходит до 15 км, зимой — в среднем 3 км. По снегу перемещается прыжками до 50 см длиной, обеими задними лапами отталкиваясь от поверхности. Он отлично плавает и легко забирается на деревья. Преследуемый врагом, часто отсиживается на дереве до тех пор, пока опасность не минует. Обычно молчалив, но в возбуждённом состоянии громко стрекочет, может чирикать, шипеть и даже лаять.
Этот мелкий хищник очень смел и кровожаден; при безвыходном положении он рискует бросаться даже на человека. К естественным врагам горностая относятся рыжая и серая лисицы, куницы, илька, соболь, американский барсук, хищные птицы; изредка его ловят обычные кошки. Многие горностаи умирают от заражения паразитической нематодой Skrjabingylus nasicola, поселяющейся в лобных пазухах; её переносчиками являются, очевидно, землеройки.
Горностай полигамен, размножается один раз в году. Половая активность у самцов продолжается 4 месяца, с середины февраля до начала июня. Беременность у самок с длинной латентной стадией (8—9 месяцев) — эмбрионы не развиваются до марта. Всего она длится 9—10 месяцев, так что детёныши появляются в апреле — мае следующего года. Количество детёнышей в помётах колеблется от 3 до 18, в среднем 4—9. Занимается ими только самка.
Новорождённые имеют массу 3—4 г при длине тела 32—51 мм, рождаются слепыми, беззубыми, с закрытыми слуховыми проходами и покрытыми редкой белой шерстью. На 30—41 день они прозревают, а в 2—3 месяца по размерам неотличимы от взрослых. В конце июня — в июле они уже самостоятельно добывают пищу.
Половой зрелости самки достигают в 2—3 месяца, а самцы лишь в возрасте 11—14 месяцев. Молодые, даже ещё слепые и не обросшие шерстью самки (в возрасте 2 - 3 недель) могут быть продуктивно покрыты взрослыми самцами — уникальный случай среди млекопитающих, способствующий выживанию вида. Половые продукты самца при этом сохраняются в организме самок до достижения ими половой зрелости.
Средняя продолжительность жизни горностая — 1—2 года, максимальная — 7 лет. Плодовитость и численность горностаев сильно колеблется, резко повышаясь в годы обилия грызунов и катастрофически падая при их вымирании.
Горностай принадлежит к распространённым хищникам, однако его численность в настоящее время сильно упала за счёт охоты, ухудшения кормовых ресурсов, уничтожения мест обитания и т. п.
Горностай является объектом промысла (мех используется как отделочный). Полезен уничтожением мышевидных грызунов.
Внесён в список самых опасных инвазивных видов по версии Международного союза охраны природы. Горностай был неудачно завезён в Новую Зеландию для контроля над популяцией кроликов; здесь размножился и превратился во вредителя, уничтожающего молодняк и яйца аборигенных птиц, в частности, киви. По достижении веса в 800 г птенцы киви в состоянии защищаться от горностаев. Предпринимаются попытки отлова горностаев на охраняемых природных территориях в Новой Зеландии.
Горностай являлся и символом персонифицированного Осязания (одного из пяти чувств).
Горностай являлся эмблемой (impresa) Анны Бретонской и её дочери Клод Французской — жены Франциска I (1494—1547), потому изображения горностая можно видеть в королевских дворцах Франции, например, в Блуа. Щит с горностаями изображён на современном гербе и флаге Бретани, перейдя на него со знамени герцогов Бретани. Существует легенда, что один из герцогов Бретани Ален Кривая борода (Alain Barbetorte), преследуемый норманнами, был остановлен разлившейся рекой, илистой и грязной. В это время герцог заметил горностая, убегающего от скачущих лошадей и тоже остановленного рекой. У самой воды горностай резко развернулся, предпочитая смерть грязи. Оценив мужество зверька, Ален II крикнул своим соратникам: «Лучше смерть, чем позор!», и воодушевлённые бретонцы повернулись лицом к противнику.
На портрете работы Леонардо да Винчи возлюбленная миланского герцога Людовико Сфорца, Цецилия Галлерани, держит в руках горностая (ныне считается что это фуро — альбиносная форма чёрного хорька (Mustela putorius furo). С одной стороны он является намёком на фамилию Сесилии, Galleriani, похожую на греческое galee (горностай); с другой — на самого Людовико Сфорца, у которого в одном из гербов присутствовал горностай.
