Komagataella phaffii ist eine Hefeart, die unter dem Namen Pichia pastoris eines der bedeutendsten Expressionssysteme der Biotechnologie darstellt. Zugleich ist Komagataella phaffii ein für die Forschung wichtiger Modellorganismus. Komagataella phaffii gehört zu den methylotrophen Hefen und ist somit in der Lage Methanol als einzige Energie- und Kohlenstoffquelle zu verwerten. Der Gattungsname ehrt dem japanischen Mikrobiologen Kazuo Komagata (* 1928).[1]
Die heute in der Biotechnologie verwendeten Stämme wurden ursprünglich fälschlicherweise als Hefeart Pichia pastoris klassifiziert und entsprechend kommerziell vertrieben. Im Zuge einer Neuklassifizierung wurde die Spezies Pichia pastoris im Jahr 1995 der Gattung Komagataella zugeordnet und in Komagataella pastoris umbenannt.[2] Anhand von rRNA-Sequenzanalysen konnte im Jahr 2009 gezeigt werden, dass es sich bei allen in der Biotechnologie verwendeten Pichia pastoris-Stämmen nicht um Komagataella pastoris, sondern um die nah verwandte Hefeart Komagataella phaffii handelt.[3] In der Biotechnologie wird dennoch weiterhin der Name Pichia pastoris für das Expressionssystem verwendet.
Pichia pastoris wurde erstmals in den 1970er Jahren von der Phillips Petroleum Company (heute: ConocoPhillips) in kommerziellem Maßstab kultiviert und direkt als proteinhaltiges Tierfutter vertrieben. Das Interesse an dem Hefepilz wurde vor allem durch seinen methylotrophen Charakter geweckt, da Methanol im Vergleich zu anderen Nährmedien sehr billig war. Bedingt durch die Ölkrise im Jahr 1973 stieg der Preis für Methanol erheblich, während zugleich der Preis für Sojabohnen, der größten alternativen Quelle für Tierfutter, sank. Die Verwendung von Pichia pastoris war somit für lange Zeit nicht mehr von wirtschaftlicher Bedeutung. Erst durch die fortschreitende Forschung im Bereich der Genetik und die Entwicklung rekombinanter DNA Technologien (Gentechnik) wurde im Laufe der Zeit Pichia pastoris als Expressionssystem zunehmend beliebter.[4] Da die Hefe von der US-amerikanischen Zulassungsbehörde, der Food and Drug Administration (FDA), den sogenannten GRAS-Status (generally recognized as safe; generell als sicher eingestuft) erhielt, hat sie sich auch für die Produktion von pharmazeutischen Wirkstoffen etabliert. Dies ist unter anderem dem Umstand zu verdanken, dass krankheitsverursachende Faktoren wie Pyrogene und lysogene Viren in Hefen nicht existent sind.
Aktuell werden mehr als 500 rekombinante Proteine (darunter einige pharmazeutische Produkte) in P. pastoris kloniert und hergestellt[5]. In der folgenden Tabelle werden einige Beispiele für die Expression organismusfremder Proteine in Pichia pastoris genannt:
Die Verwertung von Methanol bedingt das Vorhandensein von Proteinen, welche Alkohol in den Stoffwechsel der Hefe einschleusen können. In Pichia pastoris sind dies unter anderem die Alkoholoxidasen I und II (AoxI, AoxII), die als initiale Enzyme Methanol zu Wasserstoffperoxid und Formaldehyd oxidieren. Aber vor allem die Alkoholoxidase I weist eine sehr geringe Affinität für Sauerstoff auf; die Hefe kompensiert diesen Missstand, indem sie große Mengen an AoxI bildet (bis zu 30 % des Zellproteins). Damit dies möglich wird, unterliegt das AOXI-Gen der Kontrolle des sehr starken AOX-Promotors, der nur bei Vorhandensein von Methanol zur Transkription des entsprechenden Gens führt. Daraus ergibt sich ein Promotor, der durch die Zugabe von Methanol induziert werden kann. Unterstellt man nun die Gensequenz eines rekombinanten Proteins der Kontrolle eines AOX-Promotors (meist AOX1), kann in einem Fermentationsprozess die Akkumulierung von Biomasse von der eigentlichen Proteinproduktion getrennt werden, was zumeist angestrebt wird. Erst durch die Zugabe von Methanol als Induktor wird der AOX-Promotor abgelesen und somit auch das rekombinante Protein synthetisiert[7]. Pichia pastoris kann über einen weiten pH-Bereich hinweg kultiviert werden, ohne dass das Wachstum signifikant beeinträchtigt wird. Im Gegensatz zu einigen anderen Hefen, wie Saccharomyces cerevisiae, kann Pichia pastoris zu sehr hohen Zelldichten kultiviert werden. Posttranslationale Modifikationen wie die Ausbildung von Disulfidbrücken oder die Glykosylierung von Proteinen (das Anhängen von spezifischen Zuckerresten) werden von der Hefe durchgeführt. Pichia kann zudem Proteine sehr effizient sezernieren, daher aus der Zelle ausschleusen, was nachfolgende Aufbereitungsschritte (Downstream Processing) erleichtert. In Pichia pastoris zur Anwendung kommende Vektoren, das sind jene genetischen Konstrukte, die das rekombinante Protein tragen, werden meist in das Wirtsgenom integriert.
Vor allem der Glykosylierungsmechanismus von Hefen stellt ein wiederkehrendes Problem bei der Expression humaner, pharmazeutischer Wirkstoffe dar. Gewöhnlich werden in Hefen hergestellte Proteine hypermannosyliert, daher bis zu 200 Mannose-Reste werden daran angefügt (in Pichia pastoris: 8-14 Mannose-Reste). Diese Strukturen weichen in jedem Fall erheblich von der humanen Glykosylierung ab, die von einem komplexeren Typ ist. Sogenannte hypermannosylierte Proteine sind im menschlichen Organismus teilweise funktionsunfähig, können allergische Reaktionen auslösen und weisen eine sehr kurze Halbwertszeit im humanen Serum auf, da sie vor allem von Mannose-Rezeptoren in der Leber gebunden werden.[8] Um vollständig glykosylierte menschliche Proteine auch in einer Hochdichtefermentation mit Pichia pastoris herstellen zu können, wurde in den letzten Jahren an der „Humanization“ (Vermenschlichung) des Glykosylierungsapparates geforscht. Grundsätzlich werden unerwünschte Enzyme des Hefestoffwechsels, die zum Beispiel für die Hypermannosylation verantwortlich zeichnen, entfernt, während Gene, die an der menschlichen Glykosylierung beteiligt sind, mittels rekombinanter DNA-Techniken in den Organismus eingeschleust werden. 2004 konnte so erstmals das Humanprotein Erythropoietin (EPO) in seiner natürlichen, humanen Glykosylierung in einem Pichia pastoris Stamm erzeugt werden.[9][10][11] Das Ziel weiterer Forschungsarbeiten in diesem Bereich ist die Anwendung der Ergebnisse auf andere Expressionssysteme sowie die Steigerung der Expressionsraten.
Komagataella phaffii ist eine Hefeart, die unter dem Namen Pichia pastoris eines der bedeutendsten Expressionssysteme der Biotechnologie darstellt. Zugleich ist Komagataella phaffii ein für die Forschung wichtiger Modellorganismus. Komagataella phaffii gehört zu den methylotrophen Hefen und ist somit in der Lage Methanol als einzige Energie- und Kohlenstoffquelle zu verwerten. Der Gattungsname ehrt dem japanischen Mikrobiologen Kazuo Komagata (* 1928).
Komagataella is a methylotrophic yeast. within the order Saccharomycetales. It was found in the 1960s as Pichia pastoris, with its feature of using methanol as a source of carbon and energy.[2] In 1995, P. pastoris was reassigned into the sole representative of genus Komagataella, becoming Komagataella pastoris.[3] Later studies have further distinguished new species in this genus, resulting in a total of 7 recognized species.[4] It is not uncommon to see the old name still in use, as of 2023; in less formal use, the yeast may confusingly be referred to as pichia.
After years of study, Komagataella is widely used in biochemical research and biotech industries. With strong potential for being an expression system for protein production, as well as being a model organism for genetic study, Komagataella phaffii has become important for biological research and biotech applications.[1][5]
In nature, Komagataella is found on trees, such as chestnut trees.[6] They are heterotrophs and they can use several carbon sources for living, like glucose, glycerol and methanol.[7] However, they cannot use lactose.
Komagataella can undergo both asexual reproduction and sexual reproduction, by budding and ascospore.[8] In this case, two types of cells of Komagataella exist: haploid and diploid cells. In the asexual life cycle, haploid cells undergo mitosis for reproduction. In the sexual life cycle, diploid cells undergo sporulation and meiosis.[9] The growth rate of its colonies can vary by a large range, from near to 0 to a doubling time of one hour, which is suitable for industrial processes.[10]
In the last few years, Komagataella was investigated and identified as a good model organism with several advantages. First of all, Komagataella can be grown and used easily in lab. Like other widely used yeast models, it has relatively short life span and fast regeneration time. Moreover, some inexpensive culture media have been designed, so that Komagataella can grow quickly on them, with high cell density.[11] Whole genome sequencing for Komagataella had been performed. The K. phaffii GS115 genome has been sequenced by the Flanders Institute for Biotechnology and Ghent University, and published in Nature Biotechnology.[12] The genome sequence and gene annotation can be browsed through the ORCAE system. The complete genomic data allows scientists to identify homologous proteins and evolutionary relationships between other yeast species and Komagataella. In addition, all seven species were sequenced by 2022.[6] Furthermore, Komagataella are single eukaryotic cells, which means researchers could investigate the proteins inside Komagataella. Then the homologous comparison to other more complicated eukaryotic species can be processed, to obtain their functions and origins.[13]
Another advantage of Komagataella is its similarity to the well-studied yeast model — Saccharomyces cerevisiae. As a model organism for biology, S. cerevisiae have been well studied for decades and used by researchers for various purposes throughout history. The two yeast genera; Pichia (sensu lato) and Saccharomyces, have similar growth conditions and tolerances; thus, the culture of Komagataella can be adopted by labs without many modifications.[14] Moreover, unlike S. cerevisiae, Komagataella has the ability to functionally process proteins with large molecular weight, which is useful in a translational host.[15] Considering all the advantages, Komagataella can be usefully employed as both a genetic and experimental model organism.
As a genetic model organism, Komagataella can be used for genetic analysis and large-scale genetic crossing, with complete genome data and its ability to carry out complex eukaryotic genetic processing in a relatively small genome. The functional genes for peroxisome assembly were investigated by comparing wild-type and mutant strains of Komagataella.[16]
As an experimental model organism, Komagataella was mainly used as the host system for transformation. Due to its abilities of recombination with foreign DNA and processing large proteins, much research has been carried out to investigate the possibility of producing new proteins and the function of artificially designed proteins, using Komagataella as a transformation host.[17] In the last decade, Komagataella was engineered to build expression system platforms, which is a typical application for a standard experimental model organism, as described below.
Komagataella is frequently used as an expression system for the production of heterologous proteins. Several properties make Komagataella suited for this task. Currently, several strains of Komagataella are used for biotechnical purposes, with significant differences among them in growth and protein production.[18] Some common variants possess a mutation in the HIS4 gene, leading to the selection of cells which are transformed successfully with expression vectors. The technology for vector integration into Komagataella genome is similar to that in Saccharomyces cerevisiae.[19]
As some proteins require chaperonin for proper folding, Komagataella is unable to produce a number of proteins, since it does not contain the appropriate chaperones. The technologies of introducing genes of mammalian chaperonins into the yeast genome and overexpressing existing chaperonins still require improvement.[25][26]
In standard molecular biology research, the bacterium Escherichia coli is the most frequently used organism for expression system, to produce heterologous proteins, due to its features of fast growth rate, high protein production rate, as well as undemanding growth conditions. Protein production in E. coli is usually faster than that in Komagataella, with reasons: Competent E. coli cells can be stored frozen, and thawed before use, whereas Komagataella cells have to be produced immediately before use. Expression yields in Komagataella vary between different clones, so that a large number of clones has to be screened for protein production, to find the best producer. The biggest advantage of Komagataella over E. coli is that Komagataella is capable of forming disulfide bonds and glycosylations in proteins, but E. coli cannot.[27] E. coli might produce a misfolded protein when disulfides are included in final product, leading to inactive or insoluble forms of proteins.[28]
The well-studied Saccharomyces cerevisiae is also used as an expression system with similar advantages over E. coli as Komagataella. However Komagataella has two main advantages over S. cerevisiae in laboratory and industrial settings:
Comparing to other expression systems, such as S2-cells from Drosophila melanogaster and Chinese hamster ovary cells, Komagataella usually gives much better yields. Generally, cell lines from multicellular organisms require complex and expensive types of media, including amino acids, vitamins, as well as other growth factors. These types of media significantly increase the cost of producing heterologous proteins. Additionally, since Komagataella can grow in media containing only one carbon source and one nitrogen source, which is suitable for isotopic labelling applications, like protein NMR.[27]
Komagataella have been used in several kinds of biotech industries, such as pharmaceutical industry. All the applications are based on its feature of expressing proteins.
In the last few years, Komagataella had been used for the production of over 500 types of biotherapeutics, such as IFNγ. At the beginning, one drawback of this protein expression system is the over-glycosylation with high density of mannose structure, which is a potential cause of immunogenicity.[29][30] In 2006, a research group managed to create a new strain called YSH597.[a] This strain can express erythropoietin in its normal glycosylation form, by exchanging the enzymes responsible for the fungal type glycosylation, with the mammalian homologs. Thus, the altered glycosylation pattern allowed the protein to be fully functional.[31]
In food industries, like brewery and bake house, Komagataella is used to produce different kinds of enzymes, as processing aids and food additives, with many functions. For example, some enzymes produced by genetically modified Komagataella can keep the bread soft. Meanwhile, in beer, enzymes could be used to lower the alcohol concentration.[32] Recombinant phospholipase C can degum high-phosphorus oils by breaking down phospholipids.[33]
In animal feed, K. phaffi-produced phytase is used to break down phytic acid, an antinutrient.[33]
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After years of study, Komagataella is widely used in biochemical research and biotech industries. With strong potential for being an expression system for protein production, as well as being a model organism for genetic study, Komagataella phaffii has become important for biological research and biotech applications.
Pichia pastoris estas specio de gistofungoj.
Tiu mikroorganismo esta uzata en fermentado. Ĝi produktas ekzemple la brazeinon kiu estas molekulo de Pentadiplandra brazzeana. Hodiaŭ tiu ĝisto produktas por industrio plu da 500 proteinojn. [1]
Pichia pastoris estas specio de gistofungoj.
Tiu mikroorganismo esta uzata en fermentado. Ĝi produktas ekzemple la brazeinon kiu estas molekulo de Pentadiplandra brazzeana. Hodiaŭ tiu ĝisto produktas por industrio plu da 500 proteinojn.
Pichia pastoris es una levadura metilotrófica extensamente empleada en la producción de proteínas mediante técnicas de ADN recombinante. Por este motivo, Pichia pastoris se utiliza mucho en investigaciones bioquímicas y genéticas, tanto en el ámbito académico como en industrias biotecnológicas.
Se selecciona Pichia pastoris frecuentemente como sistema de expresión para la producción de proteínas. Hay un buen número de características que la hacen particularmente adecuada para este cometido. Por ejemplo, posee una alta tasa de crecimiento, incluso sobre sustratos sencillos y económicos. Además, P. pastoris logra crecer tanto en matraz como en fermentador, lo cual la hace útil tanto a pequeña como a gran escala.
Pichia pastoris está dotada de dos genes que codifican alcohol oxidasas, AOX1 y AOX2, enzimas que tienen un promotor fuerte inducible.[1] Estos dos genes explotan el metanol como fuente de carbono y fuente energética, y están activados por el propio metanol, lo que da lugar a su incorporación en azúcares tales como por ejemplo la glucosa. Normalmente el gen recombinante se inserta bajo control del promotor de AOX1, lo cual significa que la producción de proteína puede ser inducida adicionando metanol. En un difundido vector de expresión, el producto es una proteína de fusión con una señal de secreción del factor α-mating, derivado de Saccharomyces cerevisiae (la levadura de panadería). Esto permite a la proteína ser secretada en el medio de cultivo, facilitando así la subsiguiente purificación. Existen en el comercio plásmidos dotados de estas características, como por ejemplo el vector pPICZα.[2]
Se utiliza Pichia pastoris para la producción de más de 500 fármacos biológicos, como por ejemplo el interferón gamma. En cambio, una desventaja relativa al sistema de expresión de esta proteína es la excesiva glicosilación con numerosas estructuras de manosa, las cuales pueden producir una potencial inmunogenicidad.[3][4]
En biología molecular estándar, el organismo más usado para la producción de proteínas a partir de ADN recombinante es la bacteria Escherichia coli . Su elección está basada en su capacidad de crecimiento muy rápido, un buen rendimiento proteico y mínimos requerimientos de elementos nutritivos. La producción en E. coli es generalmente más rápida que la de P. pastoris por varias razones.
Las células de E. coli productivas pueden conservarse congeladas y pueden ser descongeladas poco antes del uso, al contrario que P. pastoris, que necesita de varias generaciones antes de su uso. Los rendimientos en expresión de Pichia varían extensamente con los clones seleccionados, por lo cual es necesario efectuar una selección a partir de un gran número de clones antes de lograr seleccionar un buen productor.
El proceso adecuado para obtener una inducción óptima en Pichia lleva generalmente del orden de varios días, mientras que E. coli necesita sólo de pocas horas para alcanzar las condiciones óptimas de rendimiento. Lo que hace, en cambio, Pichia preferible frente a E. coli es su capacidad de glicosilar las proteínas y generar puentes disulfuro.[5] Esto significa que en los casos en los cuales son necesarios bisulfitos, la bacteria podría producir proteínas con organización tridimensional incorrecta, es decir normalmente inactivas o insolubles.[6]
La conocida Saccharomyces cerevisiae (levadura de panadería) es también utilizable como sistema de expresión, con una serie de ventajas frente a analógos de E. coli, análogas a lo visto para Pichia. En cambio Pichia está dotada de dos peculiaridades importantes frente a Saccharomyces cerevisiae.
En primer lugar, Pichia es un metilótrofo, es decir puede crecer usando metanol como única fuente energética, y puede fácilmente crecer en suspensiones celulares dotadas de una solución de metanol razonablemente concentrado, de manera tal que con ello se elimina la posibilidad de desarrollo de la mayor parte de otros microbios, manteniendo bajos los costos de comienzo y de mantenimiento.
En segundo lugar, Pichia crece con densidades celulares muy elevadas, para las cuales en condiciones ideales está en grado de multiplicarse al punto de rendir la solución densa cuanto una especie de con la. Ya que la rendición proteica de la expresión en un microbio es alrededor igual al producto entre la cantidad de proteína por célula y el número de células, Pichia resulta ser de gran importancia cuando son necesarias producciones de elevadas cantidades de proteína sin equipo instrumental demasiado caro.
Comparada con otros sistemas de expresión, como por ejemplo las células S2 de Drosophila melanogaster o las células de ovario de Hámster chino, Pichia generalmente proporciona mejores rendimientos. Sin emabargo estas líneas celulares de organismos multicelulares requieren siempre un sustrato complejo, que incluye aminoácidos, vitaminas y factores de transcripción. El uso de estos sustratos aumenta considerablemente los costos de producción de proteínas recombinantes mediante ellos. Como Pichia es capaz de crecer en sustratos con sólo una fuente de carbono y una de nitrógeno, es adecuada para aplicaciones con marcado isotópico (por ejemplo Espectroscopia de resonancia magnética nuclear de proteínas).
En cambio, muchas proteínas requieren la actividad de una chaperonina para conseguir una organización estructural correcta, y Pichia está desprovista de esta chaperonina. En 2006 un grupo de investigación logró crear una cepa capaz de producir eritropoietina en su forma glicosilada.[7] Este resultado fue alcanzado intercambiando los enzimas responsables de la glicosilación de tipo fúngico por otros de mamífero. De ese modo, la vía de glicosilación alterada ha permitido a la proteína ser completamente funcional.
Otra ventaja de Pichia pastoris es su similitud con la más conocida Saccharomyces cerevisiae. Estas dos levaduras (Pichia y Saccharomyces) tienen condiciones de crecimiento muy parecidos, así como tolerancias nutritivas similares, por lo cual el cultivo de Pichia pastoris puede ser realizado fácilmente en laboratorios también sin especialistas o equipamientos específicos.
El genoma de la cepa GS115 de Pichia pastoris fue completamente secuenciado por el Flanders Institute for Biotechnology (VIB) y la Universidad de Gante (Ghent University - UGent) y publicado en la revista Nature Biotechnology.[8] La secuencia del genoma y la anotación funcional de los genes pueden visualizarse a través el sistema ORCAE.
Datos: Q148697
Pichia pastoris es una levadura metilotrófica extensamente empleada en la producción de proteínas mediante técnicas de ADN recombinante. Por este motivo, Pichia pastoris se utiliza mucho en investigaciones bioquímicas y genéticas, tanto en el ámbito académico como en industrias biotecnológicas.
Pichia pastoris est une levure de la classe des Saccharomycetes.
Pichia pastoris é unha especie de lévedo metilótrofo (pode usar o metanol). É moi utilizado na produción de proteínas por medio de técnicas de ADN recombinante. Utilízase en investigacións bioquímicas e xenéticas en laboratorios académicos e na industria biotecnolóxica. Pichia pastoris é o nome común utilizado para o sistema de expresión, pero o nome da especie foi posteriormente reasisgnado co nome Komagataella phaffii debido aos resultados de análises de secuencias multixénicas.[1]
P. pastoris utilízase frecuentemente como sistema de expresión para a produción de proteínas. Varias propiedades de P. pastoris fano un organismo axeitado para esta tarefa: ten unha alta taxa de crecemento e pode crecer en medios simples e baratos. Pode crecer tanto en matraces coma nun fermentador, o que o fai adecuado para a produción a pequena ou a longa escala.
P. pastoris ten dous xenes de alcohol oxidase, chamados Aox1 e Aox2, que teñen un forte promotor inducible.[2] Estes dous xenes permiten que a especie poida usar o metanol como fonte de carbono e enerxía. Os promotores AOX son inducidos polo metanol e reprimidos por, por exemplo, a glicosa. Normalmente, o xene para a proteína desexada introdúcese na célula baixo o control do promotor de Aox1, o que significa que a produción de proteínas pode ser inducida pola adición de metanol. Nun vector de expresión moi usado, a proteína desexada prodúcese como produto de fusión co sinal de secreción do factor de apareamento α de Saccharomyces cerevisiae (lévedo de panadaría). Isto causa que a proteína sexa segregada no medio de crecemento, que facilita grandemente a posterior purificación da proteína. Algúns plásmidos dispoñibles comercialmente teñen estas características incorporadas (como o vector pPICZα).[3]
Pichia pastoris foi utilizado para a produción duns 500 compostos bioterapéuticos como, por exemplo, o interferón gamma. Porén, un inconveniente dese sistema de expresión de proteínas é a sobreglicosilación con estrutura alta en manosa, que é unha causa potencial de inmunoxenicidade.[4][5]
Na investigación estándar en bioloxía molecular, a bacteria Escherichia coli é o organismo máis frecuentemente usado para a produción de ADN recombinante e proteínas, debido á alta taxa de crecemento de E. coli, unha boa taxa de produción de proteínas, e as condicións de crecemento pouco esixentes. A produción de proteínas en E. coli é xeralmente máis rápida que en P. pastoris por varias razóns: as células de E. coli competentes poden almacenarse conxeladas e desconxeladas inmediatamente antes do uso, mentres que as células de P. pastoris teñen que producirse inmediatamente antes do seu uso. Os rendementos da expresión en Pichia varía entre diferentes clons, e xeralmente debe cribarse un gran número de clons para a produción de proteínas antes de que se encontre un bo produtor. O tempo de indución óptimo de P. pastoris é usualmente da orde de días, mentres que E. coli adoita chegar ao seu rendemento óptimo en cuestión de horas despois da indución. A maior vantaxe de P. pastoris sobre E. coli é que este lévedo pode formar enlaces disulfuro e glicosilacións nas proteínas que produce.[6] Isto significa que en caso de que os enlaces disulfuro sexan necesarios, E. coli podería orixinar unha proteína mal pregada, xeralmente insoluble e inactiva.[7]
A especie ben estudada Saccharomyces cerevisiae é tamén utilizada como sistema de expresión con vantaxes similares sobre E. coli e Pichia. Porén, Pichia ten dúas vantaxes principais sobre S. cerevisiae no laboratorio e instalacións industriais, que son:
En primeiro lugar, Pichia é un metilótrofo, o que significa que pode crecer simplemente con alcohol metanol como única fonte de enerxía. Pode cultivarse doadamente en suspensión de células en solucións razoablemente fortes de metanol que matarían outros microorganismos, un sistema que é barato de establecer e manter.
En segundo lugar, Pichia pode crecer en densidades celulares moi altas, e baixo condicións ideais pode multiplicarse ata o punto en que a suspensión celular é practicamente unha pasta. Como o rendemento de proteínas da expresión nun microbio é aproximadamente igual a multiplicar o produto da proteína producida por célula polo número de células; isto fai que P. pastoris teña un grande uso cando se trata de producir grandes cantidades de proteínas sen usar un equipo caro.[6]
Comparados con outros sistemas de expresión como as células S2 de Drosophila melanogaster ou as células de ovario do hámster chinés, P. pastoris xeralmene dá rendementos moito mellores. As liñas celulares de organismos multicellares xeralmente necesitan un medio rico complexo, que conteña aminoácidos, vitaminas e factores de crecemento. Estes medios incrementan significativamente o custo de producir proteínas recombinantes. Adicionalmente, como P. pastoris pode crecer en medios que conteñan só unha fonte de carbono e unha fonte de nitróxeno, é axeitado para aplicacións etiquetadas isotopicamente en, por exemplo, a resonancia magnética nuclear de proteínas.[6] Porén, algunhas proteínas necesitan chaperoninas para un adecuado pregamento. Así, P. pastoris non pode producir varias proteínas, xa que o hóspede carece das chaperonas adecuadas. En 2006, un grupo de investigadores conseguiron crear unha cepa que produce eritropoetina na súa forma glicosilada normal.[8] Isto conseguiuse intercambiando os encimas responsables da glicosilación de tipo fúnxico, cos homólogos de mamífero. Así, o padrón de glicosilación alterado permitiu que a proteína sexa completamente funcional.
Outra vantaxe de P. pastoris é a súa semellanza co lévedo Saccharomyces cerevisiae. Como organismo modelo en bioloxía, que foi utilizado para múltiples propósitos ao longo da historia, S. cerevisiae está moi ben estudado. Estas dúas especies de lévedos teñen condicións de crecemento e tolerancias similares, polo que o cultivo de P. pastoris pode adoptarse facilmente nos laboratorios, sen ter que utilizar un equipo especial.
O xenoma de P. pastoris GS115 foi secuenciado polo Instituto de Flandres de Biotecnoloxía e a Universidade de Gante e publicado en Nature Biotechnology.[9] A secuencia xenómica e anotación de xenes pode consultarse a través do sistema ORCAE.
Pichia pastoris é unha especie de lévedo metilótrofo (pode usar o metanol). É moi utilizado na produción de proteínas por medio de técnicas de ADN recombinante. Utilízase en investigacións bioquímicas e xenéticas en laboratorios académicos e na industria biotecnolóxica. Pichia pastoris é o nome común utilizado para o sistema de expresión, pero o nome da especie foi posteriormente reasisgnado co nome Komagataella phaffii debido aos resultados de análises de secuencias multixénicas.
Pichia pastoris è una specie di lievito metilotrofico largamente impiegato per la produzione di proteine tramite l'uso delle tecniche del DNA ricombinante. Per questo motivo è molto sfruttato in ricerche biochimiche e genetiche in ambito accademico ma anche in industrie biotecnologiche.
Pichia pastoris viene frequentemente adoperata come un sistema di espressione per la produzione di proteine. Un buon numero di caratteristiche la rendono particolarmente adatta per questo compito, ad esempio possiede un alto tasso di crescita anche su un terreni semplici ed economici. Inoltre P. pastoris riesce a crescere sia in beuta, sia in fermentatore, il che la rende utile sia su piccola che su larga scala.
Pichia pastoris è dotata di due geni per alcol ossidasi, AOX1 e AOX2, i quali hanno un promotore forte inducibile.[1] Questi due geni sfruttano il metanolo come fonte di carbonio e fonte energetica; sono attivati dal metanolo stesso e repressi da zuccheri come ad esempio il glucosio. Normalmente il gene ricombinante viene inserito sotto il controllo del promotore di AOX1, il che significa che la produzione di proteina può essere indotta addizionando metanolo. In un diffuso vettore d'espressione, il prodotto è una proteina di fusione con un segnale di secrezione del fattore α-mating, derivante da Saccharomyces cerevisiae (il lievito per panificazione). Questo permette alla proteina di essere secreta nel terreno di coltura, facilitando così la successiva purificazione. Esistono in commercio dei plasmidi dotati di queste caratteristiche, ad esempio il vettore pPICZα.[2]
Pichia pastoris è adoperata per la produzione di oltre 500 farmaci biologici, come ad esempio l'interferone gamma. Tuttavia uno svantaggio relativo al sistema d'espressione di questa proteina è l'eccessiva glicosilazione con numerose strutture di mannosio, le quali possono causare una potenziale immunogenicità.[3][4]
Nella biologia molecolare standard, l'organismo maggiormente adoperato per la produzione di proteine a partire da DNA ricombinante è il batterio Escherichia coli; questa scelta dipende dalla sua capacità di crescita altamente rapida, una buona resa proteica e minime richieste di elementi nutritivi. La produzione in E. coli è generalmente più rapida rispetto a P. pastoris per varie ragioni: le cellule di E. coli rese competenti possono essere conservate congelate e possono essere scongelate poco prima dell'uso, al contrario P. pastoris necessita di varie generazioni prima dell'uso. Le rese di espressione in Pichia variano largamente a seconda dei cloni selezionati, per cui è necessario effettuare screening su un gran numero di cloni prima di riuscire a selezionare un buon produttore.
La tempistica adatta ad ottenere una induzione ottimale in Pichia è generalmente nell'ordine dei giorni, mentre E. coli necessita solo di poche ore per raggiungere le condizioni ottimali di resa. Quello che rende, invece, Pichia preferibile rispetto ad E. coli è la sua capacità di glicosilare le proteine e generare dei ponti disolfuro.[5] Questo significa che in casi in cui sono necessari bisolfiti, il batterio potrebbe produrre proteine con la scorretta organizzazione tridimensionale, ovvero solitamente inattiva o insolubile.[6]
Il noto Saccharomyces cerevisiae (lievito per la panificazione) è anche adoperabile come sistema di espressione con una serie di vantaggi rispetto a E. coli analoghi a quanto appena visto per Pichia. Tuttavia Pichia è dotata di due peculiarità importanti rispetto al lievito:
In primo luogo, Pichia essendo un metilotrofo, ovvero è in grado di crescere mediante metanolo come unica fonte energetica, può facilmente crescere in sospensioni cellulari dotati di una soluzione di metanolo ragionevolmente concentrato, tale per cui la maggior parte dei microrganismi viene eliminata, mantenendo bassi i costi di set up e manutenzione.
In secondo luogo, Pichia cresce con densità cellulari molto elevate, per cui in condizioni ideali è in grado di moltiplicarsi al punto da rendere la soluzione densa quanto una specie di colla. Poiché la resa proteica dall'espressione in un microbo è all'incirca eguale al prodotto tra la quantità di proteina per cellula e il numero di cellule, Pichia risulta essere di grande importanza quando sono necessarie produzioni di elevate quantità di proteina senza un apparato strumentale troppo dispendioso. Paragonata ad altri sistemi di espressione, come ad esempio le cellule S2 di Drosophila melanogaster o le cellule di ovario di criceto cinese (o CHO - Chinese Hamster Ovary cells), Pichia generalmente offre rese migliori. Linee cellulari da organismi multicellulari in linea di massima richiedono sempre un terreno complesso, comprendente di amminoacidi, vitamine e fattori di trascrizione. L'uso di questi terreni aumentano considerevolmente i costi di produzione per proteine ricombinanti. In aggiunta, dal momento che Pichia riesce a cresce in terreni contenenti solo una fonte di carbonio ed una di azoto, è adatta per applicazioni con marcatura isotopica (ad esempio NMR proteico). Paragonata ad altri sistemi di espressione, come ad esempio le cellule S2 di Drosophila melanogaster o le cellule di ovario di criceto cinese (o CHO - Chinese Hamster Ovary cells), Pichia generalmente offre rese migliori. Linee cellulari da organismi multicellulari in linea di massima richiedono sempre un terreno complesso, comprendente di amminoacidi, vitamine e fattori di trascrizione. L'uso di questi terreni aumentano considerevolmente i costi di produzione per proteine ricombinanti. In aggiunta, dal momento che Pichia riesce a cresce in terreni contenenti solo una fonte di carbonio ed una di azoto, è adatta per applicazioni con marcatura isotopica (ad esempio NMR proteico). Tuttavia molte proteine richiedono l'attività di chaperonine per una organizzazione strutturale corretta di cui Pichia ne è sprovvista. Nel 2006 un gruppo di ricerca è riuscita a creare un ceppo in grado di produrre eritropoietina nella sua forma glicosilata.[7] Questo risultato è stato raggiunto scambiando gli enzimi responsabili della glicosilazione di tipo fungino con quelli di mammifero. In questo modo, la via di glicosilazione alterata ha permesso alla proteina di essere completamente funzionale.
Un altro vantaggio di Pichia pastoris è la sua similarità con il più noto Saccharomyces cerevisiae (anche conosciuto come lievito per panificazione). Queste due specie di lievito (Pichia e Saccharomyces) hanno condizioni di crescita molto simili così come le loro tolleranze nutritive, per cui la coltura di Pichia pastoris può essere attuata facilmente dai laboratori anche privi di specialisti o equipaggiamenti specifici.
Il genoma del ceppo GS115 di Pichia pastoris è stato totalmente sequenziato dal Flanders Institute for Biotechnology (VIB) e dall'Università di Gand (Ghent University - UGent) e pubblicato nella rivista Nature Biotechnology.[8] La sequenza del genoma e l'annotazione funzionale dei geni possono essere visualizzati attraverso il sistema ORCAE.
Pichia pastoris è una specie di lievito metilotrofico largamente impiegato per la produzione di proteine tramite l'uso delle tecniche del DNA ricombinante. Per questo motivo è molto sfruttato in ricerche biochimiche e genetiche in ambito accademico ma anche in industrie biotecnologiche.
Pichia pastoris é uma espécie de levedura metilotrófica. É amplamente utilizada para a expressão de proteínas usando técnicas de ADN recombinante. Portanto, é utilizada na investigação bioquímica e genética em academias e na indústria de biotecnologia.
Komagataella pastoris je grzib[8], co go nojprzōd ôpisoł Guillierm., a terŏźnõ nazwã doł mu Y. Yamada, M. Matsuda, K. Maeda & Mikata 1995. Komagataella pastoris nŏleży do zorty Komagataella i familije Pichiaceae.[9][10] Żŏdne podgatōnki niy sōm wymianowane we Catalogue of Life.[9]
Komagataella pastoris je grzib, co go nojprzōd ôpisoł Guillierm., a terŏźnõ nazwã doł mu Y. Yamada, M. Matsuda, K. Maeda & Mikata 1995. Komagataella pastoris nŏleży do zorty Komagataella i familije Pichiaceae. Żŏdne podgatōnki niy sōm wymianowane we Catalogue of Life.
